Proteinase K em pó CAS 39450-01-6

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Proteinase K em póé uma serina protease altamente eficiente e não{0}}específica, amplamente utilizada em biologia molecular e bioquímica, principalmente para degradar proteínas e remover proteínas contaminantes de preparações de ácidos nucleicos. É derivado do fungo Engyodontium album (anteriormente Tritirachium album) e mantém sua atividade em uma ampla faixa de temperaturas (20-60 graus) e pH (4-12), mesmo quando incubado em solução contendo SDS (0,5-1%) ou uréia (4M) sob condições desnaturantes.

A enzima decompõe eficientemente uma ampla gama de proteínas, incluindo RNase e DNase, clivando ligações peptídicas (preferencialmente hidrolisando o terminal carboxila de aminoácidos alifáticos/aromáticos) e, portanto, é usada para remoção de nuclease na extração de DNA/RNA para garantir a integridade do ácido nucleico. Além disso, é comumente usado na digestão de tecidos (por exemplo, amostras embebidas em parafina), lise celular e estudos proteômicos.

O pó de proteinase K é geralmente fornecido na forma liofilizada, que é altamente estável (-20 graus para armazenamento a longo prazo) e precisa ser dissolvida em um tampão (por exemplo, Tris-HCl, EDTA) antes do uso. Sua atividade depende do Ca²⁺, mas agentes quelantes como o EDTA inibem apenas parcialmente a atividade enzimática. A autodegradação precisa ser evitada durante o manuseio e a inativação térmica a 65 graus é recomendada. Devido à sua potente capacidade de hidrolisação de proteínas, é necessária uma proteção cuidadosa para evitar o contato com a pele ou membranas mucosas.

Proteinase k em pó, também conhecida como Proteinase K ou EC 3.4.21.14, é uma serina protease isolada e purificada de Tritirachium album Limber. Desde o seu primeiro isolamento por Wolfgang Ebeling et al. em 1974, a proteinase K tem sido amplamente utilizada em bioquímica, biologia molecular, medicina e indústria devido à sua alta atividade e ampla especificidade de substrato.

No processo de extração de DNA e RNA, a principal função da proteinase K é degradar proteínas ligadas aos ácidos nucléicos, permitindo que o DNA ou RNA fique livre em solução para posterior extração e purificação. Devido à sua estabilidade e alta atividade em agentes desnaturantes como ureia e SDS, a proteinase K é comumente usada para o isolamento de plasmídeos ou DNA e RNA genômico.

a proteinase K pode inibir a atividade da RNAse e proteger o RNA da degradação.

1. Extração de DNA e RNA

 

Extração de DNA: A protease K pode hidrolisar histonas que se ligam ao DNA, permitindo que o DNA se dissocie em solução. Posteriormente, as impurezas foram removidas através de vários métodos, como extração com fenol e clorofórmio, precipitação com etanol, etc., e o DNA purificado foi coletado.
Extração de RNA: Durante o processo de extração de RNA, as enzimas de RNA estão comumente presentes no ambiente, e o próprio sistema de amostra também pode conter enzimas de RNA, tornando o RNA altamente suscetível à degradação. Adicionando uma pequena quantidade de

2. Tecnologia de hibridização in situ

 

Na tecnologia de hibridização in situ, a proteinase K é comumente usada para processamento de pré-hibridização para digerir proteínas que cercam o DNA alvo, aumentar a chance de ligação da sonda ao ácido nucleico alvo e melhorar o sinal de hibridização. No entanto, deve-se notar que quando a concentração de proteinase K é muito alta, o tempo de digestão é muito longo ou a temperatura de incubação é muito alta, pode causar danos à estrutura celular, levando à eliminação de seções de tecido e ao desaparecimento dos núcleos celulares, afetando assim os resultados da hibridização. Portanto, em aplicações práticas, é necessário controlar rigorosamente a concentração e o tempo de tratamento da proteinase K.

3. Inativação e desinfecção de vírus

 

A protease K, devido à sua forte atividade proteolítica, pode ser utilizada para inativação e desinfecção de vírus. A investigação demonstrou que o tratamento da água pura e das águas residuais domésticas com uma certa concentração de proteinase K pode inactivar eficazmente os vírus. A protease K, como desinfetante inativador de vírus, pode reduzir os danos potenciais causados ​​pelos desinfetantes químicos oxidativos convencionais ao corpo humano, e sua produção e transporte são seguros, sem poluição ambiental irreversível.

4. Western blotting e eletroforese de pulso

 

A protease K também tem sido amplamente utilizada na preparação de DNA cromossômico para eletroforese pulsada, Western blotting e outros experimentos. Em experimentos de Western blot, a proteinase K pode ser usada para remover proteínas não{1}}específicas da amostra, melhorando a especificidade e a sensibilidade do blot. Em experimentos de eletroforese de pulso, a proteinase K pode degradar impurezas proteicas em amostras de DNA e melhorar a eficiência da eletroforese.

5. Detecção e identificação de proteínas

 

Proteinase k em pótambém pode ser usado para a detecção e identificação de certas proteínas. Por exemplo, no estudo da encefalopatia espongiforme transmissível (TSE), a proteinase K pode ser usada para digerir proteínas em amostras de tecido cerebral e para identificar a presença de proteínas príon detectando a resistência de príons patogênicos à proteinase K. Além disso, a proteinase K também pode ser usada para experimentos como determinar a localização de enzimas nas membranas celulares e remover proteínas catiônicas ligadas a endotoxinas (como lisozima e ribonuclease A).

1. Área médica

 

Uso clínico: A protease K tem certo valor medicinal na medicina. Por exemplo, tratamento de indigestão com protease gástrica, tratamento de bronquite com protease ácida, tratamento de vasculite com elastase, etc. Além disso, tripsina, quimotripsina, etc.
Detecção e diagnóstico de vírus: A Protease K também tem aplicações potenciais na detecção e diagnóstico de vírus. Ao digerir as proteínas na amostra de vírus e expor o ácido nucleico do vírus, proporciona conveniência para testes subsequentes de ácido nucleico.

2. Setor industrial

 

Indústria do couro: A Protease K é utilizada na indústria do couro para depilação e tratamento amaciante, o que pode economizar tempo e melhorar as condições de higiene do trabalho.
Indústria têxtil: A Protease K pode ser usada em indústrias têxteis, como na degomagem de seda.
Indústria alimentícia: A protease K pode ser usada na indústria alimentícia para amaciar carne, clarificar álcool, etc.
Detergente: O detergente para a roupa com adição de enzima é um novo produto em detergentes. O detergente para a roupa contendo protease alcalina pode remover manchas de sangue e sujeira de proteínas das roupas. Mas ao usá-lo, tome cuidado para não tocar na pele para evitar danificar a proteína da superfície da pele e causar reações alérgicas como erupções cutâneas e eczema.

Características estruturais

 

O peso molecular da proteinase K é de aproximadamente 28.900 daltons (28,9 kDa), e também há relatos na literatura de 29,3 kDa. Sua sequência de aminoácidos e estrutura espacial tridimensional são altamente semelhantes à subtilisina da família das serina proteases, mas também existem algumas características únicas.

Estrutura da ligação dissulfeto: As moléculas de protease K contêm ligações dissulfeto, que aumentam sua estabilidade e permitem manter a atividade em uma ampla faixa de pH e em condições de alta temperatura.
Locais de ligação de Ca²⁺:Proteinase k em pócontém dois sítios de ligação ao Ca ² ⁺, que, embora distantes do centro ativo, são cruciais para manter a atividade catalítica da enzima. A remoção do Ca²⁺ fará com que a protease K perca cerca de 80% de sua atividade, e a reintrodução do Ca²⁺ pode restaurar apenas parcialmente sua atividade.
Tríade catalítica: A protease K possui uma tríade catalítica Asp-His69-Ser224, que é uma estrutura chave para sua atividade hidrolítica.

Mecanismo de ação

 

A protease K pode hidrolisar preferencialmente ligações éster e peptídicas adjacentes ao terminal C-de aminoácidos hidrofóbicos, aminoácidos contendo enxofre-e aminoácidos aromáticos, hidrolisando proteínas em peptídeos curtos. O seu mecanismo de ação inclui principalmente as seguintes etapas:

Ligação ao substrato da enzima: Depois que a protease K é misturada com o substrato, o substrato se liga ao sítio ativo da enzima, formando um complexo enzima-substrato.
Reação catalítica: Sob a ação do sítio ativo, a ligação peptídica do substrato é hidrolisada para formar um produto separado da enzima.
O forte efeito de degradação da protease K torna-a um reagente chave em diversas reações bioquímicas, especialmente em processos de extração de DNA e RNA. A protease K pode efetivamente degradar proteínas ligadas a ácidos nucleicos, liberar ácidos nucleicos e inibir a atividade das nucleases, reduzindo a degradação dos ácidos nucleicos durante a extração.

Proteinase k em pó, como uma serina protease altamente ativa e específica de substrato, tem uma ampla gama de aplicações em bioquímica, biologia molecular, medicina e indústria. Pode degradar proteínas que se ligam a ácidos nucleicos e liberam ácidos nucleicos; Aumentar a oportunidade para as sondas se ligarem aos ácidos nucleicos alvo na tecnologia de hibridização in situ; Usado para inativação e desinfecção de vírus; Remova impurezas proteicas em experimentos de Western blot e eletroforese de pulso; Tem valor medicinal na área da medicina; Usado em áreas industriais como processamento de couro, indústria têxtil, indústria alimentícia e fabricação de detergentes. No entanto, ao utilizar proteinase K, deve-se prestar atenção ao seu método de armazenamento e às condições de uso para garantir sua estabilidade e atividade.

A proteinase K é uma serina protease de amplo-espectro amplamente utilizada em biologia molecular, bioquímica e campos de pesquisa médica devido às suas propriedades enzimáticas exclusivas e estabilidade. Na forma de pó liofilizado-, a Proteinase K Powder desempenha um papel crucial em experimentos como extração de ácido nucleico, digestão de proteínas e homogeneização de tecidos. Porém, o uso de qualquer reagente biológico apresenta riscos potenciais, e suas reações adversas podem envolver a saúde dos operadores e a segurança do ambiente experimental.

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