Sephadex G75é um tipo de preenchimento de filtro de gel com bom desempenho. É preparado por dextrano e epicloroidrina de reticulação. É um gel em forma de contas com uma grande quantidade de grupos hidroxila, que é fácil de inchar em soluções de água e eletrólitos. O limite máximo de exclusão deste composto é de 80000 e o grau de inchaço específico depende da quantidade de resina seca e condições de operação. Por exemplo, sob certas condições, o grau de resina seco pode ser de 519 ml/g. Quando a faixa de pH operacional é de 6,210 (5.210 para alguns produtos), o composto pode permanecer estável. Recomenda -se armazená -lo à temperatura ambiente, esfriar e longe da luz na faixa de temperatura de 430 graus (ou 425 graus) para manter seu desempenho e estabilidade. Esta substância é particularmente adequada para grandes biomoléculas com um peso molecular superior a 80000. Utilizado principalmente para dessalinização e substituição tampão de biomoléculas tão grandes. Através de uma operação de etapa -, é possível dessalinizar rapidamente, remover poluentes e transferir moléculas para uma nova solução de buffer. Além da dessalinização e substituição de tampão, o Sephadex G-75 também é adequado para o processo de purificação de grandes biomoléculas.
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Sephadex G75é um gel de dextrano, usado principalmente para a tecnologia de separação e purificação em bioquímica e biologia molecular. Os principais usos desta substância são os seguintes:
No processo de dessalinização, ele pode efetivamente remover sais (geralmente sais inorgânicos de moléculas pequenas) de soluções moleculares biológicas. A vantagem dessa substância é que é fácil de operar, rápido e pode obter uma dessalinização eficaz sem alterar a atividade das biomoléculas. Além disso, devido à sua excelente estabilidade química e biocompatibilidade, é adequado para o tratamento de dessalinização de várias biomoléculas, incluindo proteínas, peptídeos, ácidos nucleicos, etc. Em aplicações práticas, a dessalinização de gel é geralmente combinada com outras tecnologias de purificação, como a troca de íons, a cromatografia de biols, etc., a atingir a compreensão.
Esta substância possui uma ampla gama de aplicações na substituição de tampão, especialmente nos campos da bioquímica e da biologia molecular. Por exemplo, no processo de purificação de proteínas, às vezes é necessário transferir proteínas de um sistema tampão para outro sistema tampão que é mais adequado para sua estabilidade e atividade. E essa substância pode efetivamente atingir esse objetivo; No processo de extração do ácido nucleico, também é necessário separar o ácido nucleico da solução contendo impurezas e sais e transferi -lo para um novo tampão para operações subsequentes. Também é aplicável a esse cenário; Durante a cultura celular, às vezes é necessário substituir o meio de cultura ou tampão para manter o crescimento e a atividade das células. Ele pode ser usado para remover substâncias nocivas da antiga mídia ou buffers de cultura e introduzir novas mídias ou buffers de cultura.
Peneiração molecular
Nos processos de pesquisa e preparação de proteínas, geralmente é necessário separar as proteínas alvo de misturas complexas. Pode separar proteínas com base em seu tamanho, alcançando assim a purificação de proteínas. Ao ajustar as condições de eluição, como a força do íons e o valor do pH do eluente, a eficiência de separação das proteínas pode ser otimizada. Além das proteínas e ácidos nucleicos, também pode ser usado para a separação e purificação de outras biomoléculas, como polissacarídeos, enzimas, anticorpos, etc. A velocidade de movimento dessas biomacromoléculas em gel depende de seu tamanho e forma, para obter uma separação eficaz. Embora essa substância não seja usada diretamente como uma ferramenta para determinação do peso molecular, ela pode servir como uma ferramenta auxiliar na determinação do peso molecular.
No processo de purificação de proteínas, geralmente é necessário remover impurezas de pequenas moléculas, como sais, metabólitos de pequenas moléculas, ligantes não ligados, etc. da solução proteica. Essa substância pode efetivamente remover essas impurezas de pequenas moléculas das soluções proteicas, melhorando assim a pureza das proteínas. Seu efeito de peneira molecular permite que essas impurezas de pequenas moléculas sejam efetivamente removidas, resultando em ácidos nucleicos mais puros. As preparações enzimáticas normalmente contêm impurezas de pequenas moléculas, como substratos, inibidores, metabólitos, etc. essas impurezas podem afetar a atividade e a estabilidade das enzimas. Através da filtração em gel do material, essas pequenas impurezas moleculares podem ser efetivamente removidas e a pureza da preparação da enzima pode ser melhorada. Além de proteínas e ácidos nucleicos,
Simular transdução de sinal intercelular
A transdução de sinal intercellular é o principal mecanismo regulador de atividades da vida, envolvendo processos complexos, como reconhecimento de células, conversão de sinais e resposta fisiológica. A pesquisa tradicional geralmente se baseia em modelos de células vivas, mas existem limitações como redes de sinais complexas e vários fatores interferentes.Sephadex G75é um meio clássico de filtração em gel de dextrano. Sua estrutura porosa e efeito de peneira molecular fornecem um modelo físico exclusivo para simular a transdução de sinal intercelular.
Um modelo físico para simular a transdução de sinal intercelular usando o Sephadex G-75
Simulação de junções intercelulares de lacunas
A junção de gap é um canal hidrofílico formado entre células adjacentes através de um ligante, permitindo a troca livre de pequenas moléculas com um peso molecular<1500 Da. The pore size range of Sephadex G-75 (40-300 μ m) is much larger than that of intercellular junctions (about 1.5 nm), but its porous structure can simulate molecular diffusion processes in local microenvironments. For example:
Formação de gradiente de moléculas de sinal: diferentes concentrações de moléculas de sinal (como CAMP, CA ²+) são carregadas na coluna de gel. A diferença de taxa de difusão de pequenas moléculas no poro do gel pode ser observada através do efeito da peneira molecular, e a transmissão de gradiente de sinais químicos entre as células pode ser simulada.
Simulação de resposta sinérgica: duas moléculas de interação (como ligante e receptor) são carregadas nas duas extremidades da coluna de gel, respectivamente, e sua cinética de ligação é analisada através da diferença de tempo de eluição para simular o processo de reconhecimento molecular na comunicação de contato direto entre as células.
Simulação de contato molecular na superfície da membrana
A comunicação entre moléculas de superfície da membrana depende das interações específicas das proteínas da superfície da membrana celular. Sephadex G-75 pode simular esse processo por meio da modificação funcional:
Receptor ligand binding experiment: biotinylated receptor proteins (such as EGFR) are fixed on the surface of gel particles, fluorescent labeled ligands (such as EGF) are captured through the streptavidin biotin system, and the binding signal intensity is monitored with a fluorescence detector to quantify the receptor ligand affinity.
Análise de ligação competitiva: pré -carregue o complexo do ligante receptor na coluna de gel, adicione inibidores competitivos de diferentes concentrações (como anticorpos anti -EGFR), calcule a constante de inibição (KI) através do deslocamento do pico de eluição e simular o efeito da intervenção dos medicamentos nas vias de sinal celular.
Simulação da transmissão de sinal químico
A transdução de sinal químico depende da difusão de moléculas de sinalização química (como hormônios e citocinas) secretadas por células através de fluidos corporais ou matriz extracelular para alvo. Sephadex g - 75 pode construir um modelo de difusão tridimensional:
Simulação do sistema parácrina: células secretoras (como macrófagos) e células alvo (como células T) são respectivamente encapsuladas nas microesferas de gel, e o status de ativação das células alvo (como a expressão de CD69) é observado através da cultura de CO para simular o efeito local dos sinais paracrinos.
Transmissão de sinal endócrino: hormônios marcados fluorescentes (como insulina) são carregados na coluna de gel, e sua interação com os poros de gel é analisada durante o tempo de eluição, e a metade -} vidas de hormônios na circulação sanguínea e distribuição de órgãos alvo são previstos pela combinação de modelos matemáticos.
Caso de aplicação de Sephadex G-75 na pesquisa de sinalização celular
Pesquisa sobre transdução de sinal de glóbulos vermelhos e função de integrina
O receptor de adesão de plaquetas integrina IIB 3 é a glicoproteína mais abundante na superfície da membrana plaquetária e é crucial para a formação de hemostasia e trombos. Estude o uso do Sephadex G-75 para simular a interação entre plaquetas e colágeno subendotelial:
Modelo de ativação da integrina: a integrina iIb 3 purificada foi fixada na superfície das partículas de gel e o fibrinogênio solúvel (FG) foi adicionado como ligante. A cinética de ligação foi detectada pela ressonância plasmônica da superfície (SPR). Verificou -se que a afinidade da integrina à FG após a ativação foi significativamente melhorada (a KD foi reduzida de μm para NM).
Triagem antiplaquetária: pré -carga Integrina FG Complexo na coluna de gel, adicione medicamentos antiplaquetários de diferentes concentrações (como o Tirofiban), calcule a taxa de inibição dos medicamentos na atividade de integrina por deslocamento de pico de eluição e fornece uma alta plataforma de triagem de título -} para o desenvolvimento de medicamentos antitrombóticos.
Regulação das vias de sinalização relacionadas ao tumor
As células tumorais promovem proliferação e metástase através da ativação anormal de vias de sinalização, como MAPK e PI3K/AKT. Sephadex G-75 pode ser usado para isolar e purificar as principais proteínas nas vias de sinalização:
Pesquisa da via do sinal EGFR: A proteína EGFR foi purificada pela filtração de gel SEPHADEX G-75 e seu status de fosforilação foi analisado por espectrometria de massa. Verificou -se que o nível de fosforilação dos locais Y1068 e Y1086 de EGFR aumentou significativamente após a estimulação do EGF, que ativou os sinais a jusante ERK1/2 e Akt.
Análise do mecanismo de resistência a medicamentos: na droga - células cancerígenas gástricas resistentes (SGC7901/VCR), a proteína UHRF1 foi isolada e purificada por Sephadex G-75, e foi encontrado que a sua superexpressão pode inibir a atitude de proteínas relacionadas a apoptose (como casease-3), Chemrother-3), a trimestridade é a atitude de atoras-5 (como casmina-3).
Sinalização celular imune e regulação de polissacarídeos
Os polissacarídeos de algas vermelhas (BFP) aumentam a resposta imune ativando as vias de sinalização NF - κ b e MAPK em macrófagos. Pesquisa sobre a separação e purificação do BFP e seus componentes (F1, F2, F3) usando o Sephadex G-75:
Polysaccharide component analysis: BFP, F1, F2 and F3 with purity>95% foram obtidos por filtração de gel G-75 Sephadex combinada com cromatografia de troca de íons Deae Cellulose 52, e seus pesos moleculares foram de 120 kDa, 85 kDa, 60 kDa e 45 kDa, respectivamente.
Ativação da via do sinal: No modelo de macrófagos RAW264.7, o BFP e seus componentes podem induzir significativamente a secreção de NO e TNF -, e seu mecanismo envolve NF - κ B translocação nuclear e fosforilação de JNK, ERK e P38 Mapk. Os componentes purificados separados por Sephadex g - 75 mostraram que F1 teve o efeito de ativação mais forte em NF - κ b e as vias MAPK (aumentando a produção de NO em 2,5 vezes e TNF - secreção em 3 vezes).
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