Azul Tiazolil CAS 298-93-1

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Azul de tiazolila, mais conhecido como MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio), abriga uma dualidade fascinante - é ao mesmo tempo uma ferramenta vital na biologia celular e uma estranheza química camaleônica. Este pó cristalino amarelo sofre uma metamorfose surpreendente nas células vivas: as redutases mitocondriais clivam o seu anel de tetrazólio, transformando-o num precipitado de formazan roxo insolúvel - uma reacção tão visualmente impressionante que se tornou o padrão ouro para medir a viabilidade celular. No entanto, além da bancada do laboratório, o MTT revela comportamentos mais esotéricos; sua estrutura cristalina forma padrões peculiares de "espinha de peixe" sob microscopia, enquanto suas propriedades redox permitem que ele participe de reações fotoquímicas exóticas quando exposto a comprimentos de onda específicos de luz. Curiosamente, o composto apresenta um fenómeno raro chamado “metacromasia” – aparecimento de cores diferentes dependendo da concentração e do ambiente molecular – uma propriedade outrora explorada por químicos têxteis para criar corantes “inteligentes”. Estudos recentes descobriram o seu papel inesperado como um inibidor fraco de certas enzimas da cadeia respiratória, sugerindo que este reagente de ensaio omnipresente pode ter influenciado subtilmente os próprios processos metabólicos que os cientistas o utilizam para estudar. Quando dissolvidas em solventes orgânicos, as soluções de MTT exibem um efeito incomum de extinção de fluorescência que tem intrigado os físico-químicos, sugerindo interações intermoleculares complexas que ainda aguardam explicação completa.

Azul Tiazolil,O nome químico é brometo de 3- (4,5-dimetil-2-tiazol) -2,5-difeniltetrazólio, abreviado como MTT, que é um importante composto orgânico. Desde que Mosman relatou pela primeira vez o uso da coloração com MTT para determinar o crescimento e a sobrevivência celular em 1983, o MTT tem sido amplamente aplicado em áreas como ciências da vida, pesquisa médica e desenvolvimento de medicamentos. A seguir está uma explicação detalhada de sua finalidade:

Aplicação em Pesquisa em Biologia Celular

 

O MTT é um dos métodos clássicos para determinar a proliferação celular. Durante a cultura celular, desidrogenases como a succinato desidrogenase nas mitocôndrias de células vivas podem reduzir o MTT exógeno a formazano cristalino roxo azul insolúvel, que se deposita na célula. As células mortas não possuem esta capacidade redutora e, portanto, não produzem formazan. Ao dissolver o formazan nas células e medir seu valor de absorção de luz em comprimentos de onda específicos (como 490 nm ou 562 nm) usando um leitor de ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA), o número de células vivas pode ser refletido indiretamente. Dentro de uma certa faixa de números de células, a quantidade de cristais de MTT formados é proporcional ao número de células, de modo que a proliferação celular pode ser determinada com base no valor de absorvância medido (valor de DO).

Aplicação em Pesquisa em Biologia Celular

 

O MTT também pode ser usado para determinar a toxicidade de medicamentos ou outros métodos de tratamento (como irradiação de radiação) em células cultivadas in vitro. Ao comparar os valores de DO do grupo de tratamento e do grupo de controle, o efeito dos medicamentos ou métodos de tratamento na atividade celular pode ser avaliado. Quanto maior o valor de DO, mais forte será a atividade celular; Pelo contrário, indica que quanto mais fraca for a actividade celular ou maior for a toxicidade celular. Este método tem amplas aplicações em triagem de drogas, pesquisa toxicológica e outros campos. Embora o MTT seja usado principalmente para medir a proliferação celular e a citotoxicidade, em alguns casos também pode ser usado para auxiliar no estudo da apoptose celular. Durante o processo de apoptose celular, a atividade enzimática dentro da célula muda, o que pode afetar a capacidade redutora do MTT. Ao comparar a diferença nos valores de DO entre células apoptóticas e células normais, a ocorrência de apoptose celular pode ser determinada preliminarmente. No entanto, deve notar-se que o MTT não é um método especializado para a detecção de apoptose celular, e os seus resultados necessitam de ser analisados ​​de forma abrangente em conjunto com outros métodos de detecção de apoptose.

Aplicação no desenvolvimento de medicamentos

 

No processo de desenvolvimento de medicamentos, o ensaio MTT é um método de triagem-de medicamentos de alto rendimento comumente usado. Ao co-incubar o medicamento de teste com células e utilizar o ensaio MTT para medir alterações na actividade celular, as potenciais moléculas activas do medicamento podem ser rapidamente rastreadas. Este método tem as vantagens de fácil operação, resultados confiáveis ​​e alto rendimento, e tem importante valor de aplicação no estágio inicial de desenvolvimento de medicamentos. O ensaio MTT também pode ser utilizado para estudar o mecanismo de ação de medicamentos. Ao comparar as alterações na atividade celular sob diferentes condições de tratamento medicamentoso, o impacto dos medicamentos em processos como a proliferação celular e a apoptose pode ser determinado preliminarmente. Ao combinar outras técnicas de biologia molecular, como Western blot e citometria de fluxo, os alvos e as vias de sinalização dos medicamentos podem ser ainda mais revelados. Na avaliação da segurança de medicamentos, o ensaio MTT pode ser usado para avaliar os efeitos tóxicos dos medicamentos nas células. Ao medir as alterações no valor de DO das células após o tratamento medicamentoso, é possível determinar se o medicamento apresenta citotoxicidade e a força da toxicidade. Isto é de grande importância para orientar a pesquisa pré-clínica e a aplicação clínica de medicamentos.

A aplicação do MTT em outros campos

 

Na pesquisa imunológica, o ensaio MTT pode ser usado para determinar a capacidade de proliferação dos linfócitos. Ao co-incubar linfócitos com antígenos ou imunoestimulantes e medir alterações na atividade celular usando o ensaio MTT, a capacidade de resposta imune dos linfócitos pode ser avaliada. Este método tem amplas aplicações no desenvolvimento de vacinas, imunoterapia e outros campos. Na pesquisa oncológica, o ensaio MTT pode ser usado para determinar a atividade de proliferação e a sensibilidade das células tumorais aos medicamentos. Ao comparar as alterações nos valores de DO das células tumorais sob diferentes condições de tratamento medicamentoso, moléculas de medicamentos com efeitos inibitórios nas células tumorais podem ser rastreadas e seus efeitos anti{4}}tumorais podem ser avaliados. Isto é de grande importância para orientar o tratamento clínico de tumores. Na pesquisa de toxicologia ambiental, o ensaio MTT pode ser usado para avaliar os efeitos tóxicos dos poluentes ambientais nas células. Ao co-incubar células com diferentes concentrações de poluentes e medir as alterações na atividade celular usando o ensaio MTT, a toxicidade e o mecanismo de ação dos poluentes podem ser determinados. Isto é de grande importância para avaliar os riscos ecológicos dos poluentes ambientais e formular políticas de proteção ambiental. 

Etapas experimentais deazul de tiazolilamétodo:

1: A tripsina digere as células da fase logarítmica, centrifuga-as e coleta-as após o término para formar a suspensão celular e ajusta sua concentração para 5-10 pela contagem de células × 104/ml. Para iniciantes, é necessário fazer com que as células atinjam 5-10 × 104/ml, muitas vezes não sabem por onde começar. Estou aqui para fornecer um método simples para determinar inicialmente o número de células.

Tomemos como exemplo 25cm2 comumente usados ​​para cultura de células:

1) A densidade celular é de cerca de 80% ~ 90% (a figura abaixo mostra o estado aproximado das células com densidade de 80% ~ 90%). Após digestão e centrifugação, retire o sobrenadante e adicione 3ml de meio para misturá-lo.

2) Pegue um novo tubo de centrífuga estéril de 15ml (para a próxima etapa de inoculação da placa de 96 poços) e preencha-o com cerca de 9ml de meio

3) Retire 1ml da suspensão de células de 3ml preparada na primeira etapa, adicione no tubo superior e conte as células após misturar. Neste momento, é geralmente 5-10 ou menos × 104/ml, o que equivale a 5-10 células por célula em 4 células do quadro de contagem de células (veja a figura abaixo); Caso a concentração não seja suficiente, a suspensão celular será adicionada de acordo com o resultado da contagem, e cada gota será calculada como 50ul.

4) O número de células deve ser ajustado de acordo com os diferentes propósitos do experimento. Por exemplo, na experiência de proliferação celular geral, podem ser utilizadas 2.000 células por poço (equivalente à densidade de suspensão celular de 2 x 104/ml), 5.000 a 10.000 células por poço (equivalente à densidade de suspensão celular de 5 x 104/ml). Além disso, o número de células também deve ser determinado de acordo com características próprias, como velocidade de crescimento. Por exemplo, a densidade de células que crescem mais rapidamente pode ser ligeiramente menor.

2. Após preparar a suspensão de células, misture suavemente e adicione 100ul em cada furo, de modo que a densidade das células a serem testadas seja 5.000-10.000/furo (o furo da borda é preenchido com PBS estéril).

L Nota: Como as células continuarão a assentar após a mistura, é necessário misturar repetidamente durante o processo de inoculação, como misturar uma vez a cada seis furos, para garantir que a densidade celular da inoculação seja exatamente a mesma entre os furos, o que é crucial para os resultados do MTT.

3. Coloque a placa de cultura celular inoculada na incubadora para cultivo até que a monocamada celular esteja coberta com o fundo do orifício (placa plana de 96 furos) e adicione o medicamento com gradiente de concentração. Em princípio, o medicamento pode ser adicionado após a fixação da célula na parede, ou duas horas, ou meio dia, mas muitas vezes adicionamos o medicamento na tarde do dia anterior e na manhã seguinte. Geralmente, são definidos 5-7 gradientes, 100ul por furo e 3-5 furos múltiplos. Recomenda-se definir 6, caso contrário será difícil refletir a situação real. A figura a seguir pode ser usada como passo de referência para placa de 96 furos.

L Para dosagem, algumas pessoas adicionam medicamentos diretamente em placas de 96 poços em volumes diferentes para formar um gradiente de concentração. Mas acho que devemos tentar misturar diferentes concentrações de medicamentos no tubo EP, depois remover o sobrenadante da cultura da placa de 96 poços (que pode ser sugado com uma pistola de descarga) e adicionar 100ul de meio de cultura contendo diferentes concentrações de medicamentos, o que pode garantir a precisão da concentração do medicamento. Além disso, deve-se observar que, se este método for utilizado, não aspire toda a solução de cultura da placa de 96 poços antes de adicionar o medicamento. Você deve adicionar amostras imediatamente após sugar uma parte delas para evitar a morte celular devido à secagem da placa de 96 poços.

Incubar com 4,5% de CO2 a 37 graus por 16-48 horas e observar o efeito da droga no microscópio invertido. A figura a seguir mostra um gradiente típico de citotoxicidade do medicamento.

4. Adicione 10ul de solução de MTT (5mg/ml, ou seja, . 0.5% de MTT) a cada poço e continue a cultura por 4h. Se o medicamento puder reagir comazul de tiazolilaa solução de cultura pode ser descartada após a centrifugação, e a solução de cultura contendo MTT pode ser adicionada após ser lavada com PBS por 2-3 vezes.

5. Pare a cultura e prepare-se para dissolução e cristalização.

Azul Tiazolil, cujo nome chinês é Azul de Metila, é um importante composto orgânico amplamente utilizado na medicina, biologia e química. na medicina, é frequentemente usado para tratar envenenamento por nitrito, envenenamento por cianeto, etc., e também é usado no diagnóstico e tratamento adjuvante de algumas doenças; Na pesquisa biológica, pode ser usado como agente de coloração para rotular células ou tecidos. No entanto, como muitos medicamentos, o azul de metileno também pode apresentar uma série de efeitos colaterais durante o uso:

Efeitos colaterais do sistema digestivo

Náuseas e vômitos são um dos efeitos colaterais comuns do azul de metileno no sistema digestivo. Quando o azul de metileno entra no corpo, pode estimular a mucosa gastrointestinal, causando náuseas e até vômitos em casos graves. Este sintoma é mais pronunciado quando a velocidade da injeção intravenosa é muito rápida ou a dosagem é muito grande. Por exemplo, em alguns casos clínicos, os pacientes podem sentir náuseas e vómitos significativos logo após a injeção intravenosa rápida de azul de metileno, o que afeta o seu conforto e experiência de tratamento. Alguns pacientes podem sentir dor abdominal após o uso do azul de metileno, e o grau de dor pode variar dependendo das diferenças individuais, variando de um leve desconforto a uma dor mais intensa.

Ao mesmo tempo, também pode ser acompanhada de diarreia, que pode ser devida à interferência do azul de metileno no peristaltismo intestinal e na função digestiva, levando a movimentos intestinais anormais e alterações na secreção do líquido digestivo.A ocorrência prolongada ou frequente de dor abdominal e diarreia não afeta apenas a absorção de nutrientes e a saúde física do paciente, mas também pode levar a outras complicações.

Efeitos colaterais do sistema urinário

Após o uso do azul de metileno, a cor da urina ficará azul, o que é causado pela excreção do azul de metileno e seus metabólitos na urina através dos rins. Em geral, esta alteração na cor da urina é temporária e não terá um impacto grave na saúde física. Mas em alguns casos especiais, como pacientes com doenças do sistema urinário, alterações na cor da urina podem interferir no diagnóstico da doença, e os médicos precisam realizar uma análise abrangente com base em outros indicadores do exame. Durante a micção, alguns pacientes podem sentir uma sensação de ardor na abertura uretral.

 

Isto pode ser devido ao efeito estimulante do azul de metileno na mucosa uretral, especialmente quando a concentração de urina é elevada ou a mucosa uretral é friccionada durante a micção, a sensação de ardor será mais pronunciada. Esse sintoma pode causar certo desconforto ao paciente e afetar seu dia a dia.

Efeitos colaterais neurológicos

Tonturas e dores de cabeça são efeitos colaterais neurológicos comuns do azul de metileno. Depois de usar o azul de metileno, os pacientes podem sentir tonturas e desorientação na cabeça, ou sentir desconforto como inchaço e dor na cabeça. Esse sintoma pode afetar a atenção e a capacidade de raciocínio do paciente e reduzir a eficiência no trabalho e na vida. A ocorrência de tonturas e dores de cabeça pode estar relacionada aos efeitos do azul de metileno nos vasos sanguíneos e nervos cerebrais, e o mecanismo específico ainda necessita de mais pesquisas. Em casos raros, o azul de metileno pode causar distúrbios de consciência, como sonolência, coma, etc.

Isso geralmente se deve ao uso excessivo de azul de metileno ou à sensibilidade excessiva dos pacientes ao medicamento, causando inibição grave do sistema nervoso central. Os distúrbios de consciência são um efeito colateral grave que pode colocar em risco a segurança da vida do paciente e exigir tratamento de resgate imediato.

1.Qual é a utilidade do brometo de tetrazólio azul de tiazolila?

Azul de tiazolil Azul de tetrazólio (MTT) pode ser usado na medição da proliferação celular. O MTT produz uma solução amarelada que é convertida em formazan MTT azul escuro e insolúvel em água-pelas desidrogenases mitocondriais de células vivas.

2.O Tiazolil Azul é seguro para armazenar?

Condições de temperatura: Sele o pó e armazene-o na geladeira a -20 graus para preservação por congelamento, o que pode efetivamente prolongar a vida útil (geralmente de 1 a 2 anos); para armazenamento de curto prazo (dentro de 1 mês), pode ser mantido temporariamente em condições de refrigeração de 4 graus.

Requisitos à prova de luz-e à prova de umidade-: O pó de MTT é sensível-à luz e deve ser armazenado em frascos de reagentes marrons ou transparentes embrulhados em papel alumínio. Enquanto isso, agentes secantes (por exemplo, sílica gel) devem ser adicionados para evitar que o pó absorva umidade e endureça.

3. A cor do Azul Tiazolil mudará?

Quando a solução apresenta um precipitado azul púrpura ou escurece, indica que foi oxidada e não pode continuar a ser utilizada.
Evite colocar a solução em temperatura ambiente ou em ambiente claro, pois ela pode falhar rapidamente.

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